El 25 de abril, a la una de la madrugada, los ingenieros iniciaron la entrada de las barras de regulación en el núcleo del reactor, refrigerado por agua y moderado por grafito (que pertenece al tipo que los soviéticos llaman RMBK-1000), para llevar a cabo una prueba planeada con anterioridad, bajo la dirección de las oficinas centrales de Moscú. La potencia térmica en este caso desciende normalmente de 3.200 a 1.600 MW.
Hacia las 23 horas se habían ajustado los monitores a los niveles más bajos de potencia. Pero el operador se olvidó de reprogramar el ordenador para que se mantuviera la potencia entre 700 MW y 1.000 MW térmicos. Por este motivo, la potencia descendió al nivel, muy peligroso, de 30 MW.
El comienzo de un incendio, que no se consiguió apagar hasta el 9 de mayo, aumentó los efectos de dispersión de los productos radiactivos, y la energía calorífica acumulada por el grafito dio mayor magnitud al incendio y a la dispersión atmosférica.
De los productos radiactivos liberados eran especialmente peligrosos el yodo-131 (cuyo período de semidesintegración es de 8,04 días) y el cesio-137 (con un período de semidesintegración de unos 30 años), de los cuales, aproximadamente la mitad, salieron de la cantidad contenida en el reactor. Además, se estimó que todo el gas xenón fue expulsado al exterior del reactor. Estos productos se depositaron de forma desigual, dependiendo de su volatilidad y de las lluvias durante esos días.
Los más pesados se encontraron en un radio de 110 km, y los más volátiles alcanzaron grandes distancias. Así, además del impacto inmediato en Ucrania y Bielorrusia, la contaminación radiactiva alcanzó zonas de la parte europea de la antigua Unión Soviética, y de Estados Unidos y Japón. En España, el Consejo de Seguridad Nuclear (CSN) detectó pequeñas cantidades de yodo-131 y cesio-137, por debajo de los límites aceptables de dosis de radiación, en las regiones mediterráneas y en Baleares.
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